幾種常用轉(zhuǎn)化細胞的轉(zhuǎn)化

1）致癌化學(xué)物轉(zhuǎn)化細胞：轉(zhuǎn)化敘利亞地鼠胚胎細胞實驗
1．取材：妊娠后第13天取材，取數(shù)個同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0.25％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）37℃消化30分鐘，濾過、低速離心、吸除消化液、加入營養(yǎng)液、制備成細胞懸液、接種入75cm/培養(yǎng)瓶中，接種密度10～20×106/75cm，37℃培養(yǎng)2～3天，在順利情況下能迅速長滿瓶面。
2．貯存：選大批生長狀態(tài)良好的細胞凍存，儲以備用。
3．致癌物處理：取凍存細胞，解凍，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含細胞10萬～30萬。待細胞生長進入指數(shù)增生期時，向培養(yǎng)瓶中加入致癌劑MNNG。致癌劑量1～3微克/毫升營養(yǎng)液。在37℃溫箱中培養(yǎng)12～48小時。
4．低血清培養(yǎng)：棄掉MNNG作用液，用溫PBS洗1～3次，加入含20％小牛血清，繼續(xù)置溫箱中培養(yǎng)2～3周，然后改用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。低血清培養(yǎng)液不利于正常細胞生長，但已轉(zhuǎn)化的細胞仍能增殖和形成轉(zhuǎn)化灶。
5．轉(zhuǎn)化灶形成和分離：在成功情況下，用致癌物處理過的細胞于10天后在正常細胞之間，可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶。

2）病毒轉(zhuǎn)化細胞
1．血液制備：檸檬酸（Citric Acide）或肝素抗凝取血1～2ml，分裝入管中，每管0.5ml全血，置于4℃冰箱中30分鐘。
2．EBV病毒轉(zhuǎn)化：從液氮中取出凍存的0.5ml全血，在37℃水中迅速解凍。
3．將解凍細胞與10ml不含血清的RPMI 1640混合，2500 rpm離心2分鐘，棄上清，用含20％的胎牛血清、青、鏈霉素和慶大霉素的RPMI 1640生長培養(yǎng)基重懸細胞。
4．加入0.3～0.5ml的EBV病毒液，37℃水浴30分鐘～2小時，并不時搖動，以免出現(xiàn)凝塊。
5．分裝入50ml的培養(yǎng)瓶中，同時補加適量培養(yǎng)液，置入含5％CO2溫箱中，100％溫度下培養(yǎng)。
6．一周后加補入2ml培養(yǎng)基。
7．經(jīng)常鏡檢培養(yǎng)物，每3～4天加液或換液，隨細胞數(shù)量增多，可分裝入大瓶中培養(yǎng)。

3）  癌基因轉(zhuǎn)化細胞：基因組DNA轉(zhuǎn)染法
1．提取基因DNA（含癌基因）。
2．DNA準(zhǔn)備：取供體DNA50～100微克，加3M NaCl或醋酸鈉使終濃度至0.3M混勻。
3．再加2倍體積無水乙醇，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去上清。
4．加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA充分融解后，再加入2.5M CaCl2，令終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次。置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁藍色時，即可用于轉(zhuǎn)染受體細胞。
5．細胞：取生長狀態(tài)良好、處于半?yún)R合階段的指數(shù)增生期細胞，在轉(zhuǎn)染前24小時，更換培養(yǎng)液1次。
6．轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA－磷酸鈣沉淀物0.5～1ml/瓶，置37℃作用4～6小時。
7．培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15％甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，加入新培養(yǎng)液，37℃溫箱培養(yǎng)24小時。
8．傳代：按1：5或1：10分瓶傳代，每2～3天換液1次，接近匯合時血清用量降至5％，培養(yǎng)2～3周。
9．檢測：逐日觀察，待出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶后，分離入另瓶中培養(yǎng)。