關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞的研究

　　神經(jīng)組織的再生是困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一，近年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)成人中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell, NSC）的存在，但大部分NSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，從體內(nèi)分離、激活NSC，具有非常廣闊的生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用前景，已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病研究的焦點(diǎn)。本文擬就NSC研究的新進(jìn)展及其應(yīng)用前景綜述如下。

　　1  NSC的分布

　　1992年Reynolds等［1］和Richards等［2］先后從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出NSC,首先打破了成體哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)觀念。成體哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在兩個(gè)NSC聚集區(qū)：側(cè)腦室壁的腦室下層（sub ventricular zone, SVZ）和海馬齒狀回的顆粒下層（sub granular zone, SGZ）［3］。用免疫熒光標(biāo)記SVZ的干細(xì)胞，在活體可以清晰地觀察到增殖的細(xì)胞從腦室遷移到嗅球的軌跡［4］；SGZ的干細(xì)胞則發(fā)育形成顆粒細(xì)胞,并與海馬齒狀回建立突觸［5］。在人胚NSC的研究，已從大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、腦室沿線包括側(cè)腦室、第三腦室和第四腦室、間腦、中腦、小腦、脊髓、視網(wǎng)膜中分離得到NSC，或具有比NSC更明確發(fā)展方向的神經(jīng)祖細(xì)胞。

　　2  NSC的基本生物學(xué)特性

　　Mckay［6］于1997年提出，NSC是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。其生物學(xué)特性主要有以下幾方面。

　　2.1  自我更新  NSC具有高度增殖和自我更新以維持自身數(shù)目恒定的能力。通過兩種方式實(shí)現(xiàn),對稱分裂：干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞都是干細(xì)胞；不對稱分裂：干細(xì)胞分裂產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)分化的子代細(xì)胞,后者終分化為終末細(xì)胞。NSC增殖，互相聚集成神經(jīng)球,根據(jù)大小和培養(yǎng)的時(shí)間，神經(jīng)球可含有NSC、正在分化的神經(jīng)前體細(xì)胞、凋亡細(xì)胞,甚至已分化的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等。NSC繼續(xù)增殖,則生長出許多子代的神經(jīng)球［7］。Vescovi等［8］報(bào)道,NSC可在體外持續(xù)傳代達(dá)3年以上，分裂后的子代干細(xì)胞具有與母代干細(xì)胞*相同的生物學(xué)特性。

　　2.2  多潛能分化  NSC分化后可形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,其分化與局部微環(huán)境密切相關(guān)。目前NSC的誘導(dǎo)分化可通過生長因子誘導(dǎo)、基因調(diào)控及信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)等途徑。

　　2.3  遷移功能和良好的組織融合性  在人類和哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中, NSC沿著發(fā)育索方向遷移。移植后的NSC同樣具有遷移能力,且受病變部位神經(jīng)源性信號的影響,移植后的NSC具有向病變部位遷移的趨化性,并分化成特異性細(xì)胞［9］。腦室內(nèi)移植的NSC可以通過血腦屏障,遷移至腦實(shí)質(zhì)中與宿主細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上形成初步良好的整合,參與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。

　　2.4  高度未分化狀態(tài)及低免疫原性  NSC增殖能力處于較原始的未分化狀態(tài),呈巢蛋白（nestin）陽性,缺乏已分化細(xì)胞的抗原標(biāo)志,無成熟細(xì)胞相應(yīng)的特異性標(biāo)志，不表達(dá)成熟細(xì)胞的抗原,具有低免疫原性,在移植后較少發(fā)生異體排斥反應(yīng),利于其存活［10］。

　　2.5  轉(zhuǎn)分化和去分化  Bjornson等［11］發(fā)現(xiàn)小鼠NSC植入同種異體血管內(nèi)可逆轉(zhuǎn)分化成血細(xì)胞。Clarke等［12］將Lac-z標(biāo)記的小鼠NSC移入雞和小鼠囊胚中,可逆轉(zhuǎn)分化成為內(nèi)中外3個(gè)胚層,經(jīng)研究證實(shí)利用NSC可實(shí)現(xiàn)跨胚層分化,如分化為骨骼肌細(xì)胞及造血系統(tǒng)的各系細(xì)胞等。但隨著研究的深入,越來越多的科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的事實(shí)和成體組織中存在成體干細(xì)胞的證據(jù),向“橫向分化”、“跨胚層分化”學(xué)說等提出質(zhì)疑, Nature（2004）刊登了兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室的2篇論著 ［13,14］，各自用充分的事實(shí)證明,輸注的CD34+造血干細(xì)胞到達(dá)損傷的心肌部位卻仍然分化為CD45+造血細(xì)胞,而沒有變?yōu)樾募〖?xì)胞的任何證據(jù)。

　　3  NSC的來源、分離、培養(yǎng)及鑒定

　　3.1  NSC的來源  NSC主要從以下幾種途徑獲得：（1）來源于神經(jīng)組織［15］;（2）來源于胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞等細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化［16］;（3）來源于血液系統(tǒng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞［17］、成年多能祖細(xì)胞［18］及臍血細(xì)胞［19］;（4）來源于永生化細(xì)胞系 C17-2細(xì)胞系［20］（由新生小鼠小腦外顆粒層細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)V-Myc后獲得的克隆多能干細(xì)胞系）、MHP36細(xì)胞系［21］（從轉(zhuǎn)導(dǎo)溫度敏感型tsA58原癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬增殖區(qū)獲得，是一種溫控型NSC。在體外33℃時(shí)增殖，在體內(nèi)較高溫度37℃時(shí)分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞）、NT2細(xì)胞系［21］（從人睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中獲得，在維甲酸的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出NSCs的特性）;（5）體核細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得NSC ［22］。

　　3.2  NSC的分離純化方法  目前建立起的NSC的分離方法有：（1）反復(fù)傳代法。取3～4個(gè)月齡的人胚胎紋狀體或孕 14～16天小鼠、大鼠胚胎大腦，機(jī)械分離制作單細(xì)胞懸液。在含多種神經(jīng)因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)NSC的體外穩(wěn)定有效擴(kuò)增。經(jīng)過長期培養(yǎng)反復(fù)傳代可使NSC得到純化。（2）流式細(xì)胞術(shù)。Sasaki等［23］采用流式細(xì)胞儀對約60種細(xì)胞表面抗原進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分選出的具有CD133+/CE34+/CD45-（細(xì)胞表面抗原）的細(xì)胞為NSC。（3）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。Keyoung ［24］等利用腺病毒為載體,將置于歸巢素和Msi1增強(qiáng)子和啟動子控制下的綠色熒光蛋白基因?qū)肴伺咛ゼ?xì)胞,然后對胚胎細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),只有NSC能特異性地出現(xiàn)綠色熒光蛋白。再利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光篩選,能進(jìn)一步將NSC收集起來。（4）免疫磁珠細(xì)胞分選法。利用磁珠表面的特異性抗體與NSC表面抗原結(jié)合，在磁場作用下使結(jié)合磁珠的NSC與其他細(xì)胞分離，從而得到較純化的NSC。

　　3.3  NSC的鑒定  巢蛋白（Nestin）是一種神經(jīng)元中間絲蛋白［25］,其表達(dá)始于神經(jīng)胚形成時(shí),當(dāng)NSC遷移基本完成,巢蛋白的表達(dá)量逐漸減少,并隨NSC分化的完成停止表達(dá)。免疫組化證實(shí)NSC均呈Nestin陽性。Okano等［26］鑒定出一種RNA結(jié)合蛋白即 Musashi ,可作為NSC的標(biāo)志物。對分離培養(yǎng)得到的NSC進(jìn)行標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn),Nestin和Musashi呈雙重陽性,且隨著NSC分化成為神經(jīng)元,二者的標(biāo)記作用也消失,說明Musashi具有與Nestin相似的特異性和種間保守性。Nestin和Musashi作為早期原始神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物已被廣泛地應(yīng)用于NSC的鑒定。

　　4  NSC的應(yīng)用前景

　　4.1  NSC原位誘導(dǎo)  內(nèi)源性NSC的自身激活。大量體外和在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)成年腦中存在NSC。研究影響NSC增殖和分化的信號作用的實(shí)驗(yàn)［27］證實(shí),腦室管膜下區(qū)等部位的NSC在腦損傷發(fā)生后能夠增殖、遷移到受損部位并分化成新的神經(jīng)細(xì)胞，取代受損腦組織細(xì)胞。在大多數(shù)情況下,僅由內(nèi)源性干細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)組織可能不足以替代損傷后缺失的神經(jīng)組織,尤其在脊髓、紋狀體等神經(jīng)組織發(fā)生很少的部位［28］?？赡茉蛴校海?）原位誘導(dǎo)出功能特異的神經(jīng)元可能需要多種刺激和特定細(xì)胞因子的作用。（2）患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞缺陷或無法激活。

　　4.2  異體神經(jīng)干細(xì)胞移植  臨床試驗(yàn)表明,移植胎兒腦組織治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可以明顯改善癥狀。但胎腦的來源有限,受倫理和法律上的束縛,限制研究的發(fā)展。NSC的發(fā)現(xiàn)和體外分離培養(yǎng),為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代療法拓寬了道路。在體外培養(yǎng)擴(kuò)增的NSC移植到腦疾病動物模型腦內(nèi)的實(shí)驗(yàn)［29］表明,體外培養(yǎng)的NSC移植到腦內(nèi)后能夠遷移分化為特定部位的神經(jīng)細(xì)胞,其分化方向與所處的微環(huán)境密切相關(guān)。Vescovi等［30］在研究細(xì)胞移植治療帕金森病時(shí)發(fā)現(xiàn),在體外實(shí)驗(yàn)中沒有必需的因素干預(yù)下, NSC自然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細(xì)胞總數(shù)的0.5%～5%。因此,誘導(dǎo)NSC向修復(fù)所需的神經(jīng)功能（目的）細(xì)胞分化成為研究的核心問題。

　　4.3  基因治療  基因治療是通過特定載體相關(guān)外源基因?qū)塍w內(nèi),使其獲得表達(dá),達(dá)到治療由于某種基因缺陷或突變引起的疾病。目前神經(jīng)系統(tǒng)基因治療常用的靶細(xì)胞有：（1）成纖維細(xì)胞,來自間充質(zhì),能在體外分裂增殖,具有較高的病毒感染率但植入腦后不能與宿主整合；（2）永生化神經(jīng)祖細(xì)胞,體外容易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和能與宿主整合等優(yōu)點(diǎn),但存在致癌的危險(xiǎn)；（3）NSC來源于神經(jīng)組織,比永生化NSC更能保持原有的生物學(xué)特性,具有分化能力和更好的組織相容性,可以整合到宿主腦組織并向周圍遷移,不形成腫瘤等。

　　4.4  NSC的其他應(yīng)用  NSC具有穩(wěn)定的生物學(xué)性狀,建系以后可以獲得均一的遺傳背景,具有組織和種屬特異性，可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺。利用NSC的多向分化潛能,可篩選出控制和促進(jìn)NSC向終末細(xì)胞分化的藥物。另外,利用攜帶報(bào)告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染腦內(nèi)可增殖細(xì)胞來追蹤神經(jīng)前體細(xì)胞的分布、增殖分化和遷移情況,研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。