非蛋白巰基測定試劑盒說明書 微量法 技術(shù)文章

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非蛋白巰基檢測試劑盒

商品貨號：MS1520
英文名稱：Non-protein sulfhydryl group Assay Kit
別名：非蛋白質(zhì)巰基試劑盒 非蛋白質(zhì)巰基測試盒
檢測方法：微量法

• 產(chǎn)品詳細(xì)介紹
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測定意義：

生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能，對生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。

測定原理：

巰基基團(tuán)與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有大吸收峰。

• 產(chǎn)品說明書

貨號：MS1520                                    規(guī)格：100 管/48 樣

非蛋白巰基測定試劑盒說明書 微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功 能，對生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。

測定原理：

巰基基團(tuán)與 5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在 412nm 處 有大吸收峰。 自備實驗用品及儀器： 天平、研缽、恒溫水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板和甲醇。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 1 mL×1 管，4℃避光保存。

樣品的制備：

1. 動物、植物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后加入 4mL 甲醇，室溫震蕩 10min，然后 10000g， 4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì) 胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min） 然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

3. 血清、培養(yǎng)液：取 0.1mL，加 0.4mL 甲醇，室溫震蕩 10min，然后 10000g，4℃離心 10min， 取上清置冰上待測。

操作步驟：

1、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表

                     對照管              測定管

樣品（μ L）              40                 40 

試劑一（μ L）            150                 150

試劑二（μ L）                               10

H2O（μ L）              10 

計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.7236 x，R 2 = 0.9994

1. 組織：

非蛋白質(zhì)巰基含量（μ mol/g 鮮重）= 1.7236 /A ×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×W) ×5=14.5×Δ A÷ W

2. 血清、培養(yǎng)液：

非蛋白質(zhì)巰基巰基含量（μ mol/mL）= 1.7236 /A ×V 反總÷V 樣×5=14.5×Δ A

3. 細(xì)胞：

非蛋白質(zhì)巰基含量（μ mol/10^4）= 1.7236 /A ×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量) ×5 =14.5×Δ A÷細(xì)胞數(shù)量

V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL； W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；

注意事項： 低檢出限為 10μ mol/L。

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8618x，R 2 = 0.9994

1. 組織：

非蛋白質(zhì)巰基含量（μ mol/g 鮮重）= 0.8618 /A ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×5= 29×Δ A÷W

2. 血清、培養(yǎng)液：

非蛋白質(zhì)基含量（μ mol/L）= 0.8618/A ×V 反總÷V 樣×5=29×Δ A

3. 細(xì)胞：

非蛋白質(zhì)巰基含量（μ mol/10^4）= 0.8618 /A ×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量) ×5 =29×Δ A÷細(xì)胞數(shù)量

V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL； W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；

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