乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒 微量酶標(biāo)儀法 說(shuō)明 技術(shù) 文章

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乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒

商品貨號(hào)：MS1001
英文名稱：Micro Lacate Dehydrogenase（LDH）Assay Kit
別名：乳酸脫氫酶試劑盒 LDH Kit 乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒 乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒
檢測(cè)方法：微量法

• 產(chǎn)品詳細(xì)介紹
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• 產(chǎn)品說(shuō)明書

測(cè)定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD+/NADH之間互變。

測(cè)定原理：

LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

貨號(hào)：MS1001                                                     規(guī)格：100管/48樣

乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說(shuō)明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD⁺/NADH之間互變。

測(cè)定原理：

LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶， 4℃保存；

試劑一：液體5mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入1.3 mL蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑

        分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體5 mL×1瓶，4℃避光保存；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴15min

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴15min

充分混勻，室溫靜置15min， 450 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

LDH活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線， y = 0.725x   (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為對(duì)吸光度)。

2、血清（漿）LDH活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=ΔA÷0.725÷T×10³=92×ΔA

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =92×ΔA÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =92×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.046×ΔA

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬(wàn)；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線， y = 0.3625x   (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為對(duì)吸光度)。

2、血清（漿）LDH活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=ΔA÷0.3625÷T×10³=184×ΔA

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA÷0.3625×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =184×ΔA÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[ΔA÷0.3625×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =184×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [ΔA÷0.3625×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.092×ΔA

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬(wàn)；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。