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輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒 常量可見分光光度法 說明 技術(shù) 文章

更新時(shí)間:2019-03-29  |  點(diǎn)擊率:2054
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輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒

商品貨號(hào):QS1000
英文名稱:NAD(H) Kit
別名:輔酶Ⅰ含量測定試劑盒 NAD(H) Kit 輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒 輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒
檢測方法:常量法

 

商品貨號(hào):商品品牌:規(guī)格基本售價(jià)選擇規(guī)格
QS1000-50管/24樣 50管/24樣¥500.00元 

 

  • 產(chǎn)品詳細(xì)介紹
  •  
  • 產(chǎn)品說明書

 

測定意義:

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成ATP的同時(shí),形成大量的ROS,同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH,NADH通過PMS的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在570nm下檢測吸光值;而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用MTT還原法檢測。

貨號(hào):QS1000                                                      規(guī)格:50管/24樣                                     

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成ATP的同時(shí),形成大量的ROS,同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH,NADH通過PMS的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在570nm下檢測吸光值;而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用MTT還原法檢測。

自備的實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

酸性提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;

堿性提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體15 mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:液體4 mL×1瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1瓶,-20 ℃避光保存,用時(shí)加入4mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4℃

        保存一周;  

試劑四:粉劑×1瓶,4 ℃避光保存,用時(shí)加入4mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4℃保

        存一周;

試劑五:液體1.8mL×1支,4 ℃保存;

試劑六:液體30mL×1瓶,4 ℃保存;

試劑七:液體50mL×1瓶,4 ℃保存。

NAD+和NADH的提取

1 血清(漿)中NAD+和NADH的提取

NAD+的提?。喊凑昭澹{)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH的提?。喊凑昭澹{)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL堿性提取液),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2組織中NAD+和NADH的提取:

NAD+的提?。喊凑战M織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+和NADH的提?。?/span>

NAD+的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):酸性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):堿性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟:

  1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至570nm,蒸餾水調(diào)零。
  2. 加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣):

試劑名稱(μL)

對照管

測定管

樣本

50

50

試劑一

250

250

試劑二

75

75

試劑三

75

75

試劑四

75

75

試劑五

35

35

試劑六

500

混勻,室溫避光靜置20min

試劑六

 

500

充分混勻,靜置5min后,20000g,25℃離心5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

1000

1000

混勻,570nm下比色,讀取對照吸光值A(chǔ)1和測定管吸光值A(chǔ)2,計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管,本試劑盒50管保證測24個(gè)NAD+或NADH.。

NAD+和NADH含量的計(jì)算

(一)NAD+含量的計(jì)算

1、血清(漿)中NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.099)×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+ (nmol/mg prot)=[ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+ (nmol/g 鮮重)= [ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099)÷W

 (3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+ (nmol/104 cell)=[ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099)

(二)NADH含量的計(jì)算

1、血清(漿)中NADH含量計(jì)算

NADH含量(nmol/mL)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADH含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

注意:低檢測限為1nmol/mL或1nmol/g鮮重 或0.01nmol/mg prot

輔酶Ⅰ系列    
QS1000輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒可見分光光度法50管/24樣500
MS1000輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒微量法100管/48樣920
QS1001乳酸脫氫酶(LDH)測試盒可見分光光度法50管/24樣170
MS1001乳酸脫氫酶(LDH)測試盒微量法100管/48樣330
QS1002NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)測試盒紫外分光光度法50管/48樣280
MS1002NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)測試盒微量法100管/96樣550
QS1003NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)測試盒紫外分光光度法50管/48樣320
MS1003NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)測試盒微量法100管/96樣600
QS1004NADH氧化酶(NOX)測試盒  可見分光光度法50管/48樣450
MS1004NADH氧化酶(NOX)測試盒  微量法100管/96樣850
QS1005-50檸檬酸合酶(CS)測試盒可見分光光度法50管/48樣3200
QS1005-25檸檬酸合酶(CS)測試盒可見分光光度法25管/24樣2000
MS1005檸檬酸合酶(CS)測試盒微量法100管/48樣3500
QS1006丙酮酸脫羧酶(PDC)測試盒紫外分光光度法50管/48樣720
MS1006丙酮酸脫羧酶(PDC)測試盒微量法100管/96樣1400
QS1007醇脫氫酶(ADH)測試盒紫外分光光度法50管/48樣280
MS1007醇脫氫酶(ADH)測試盒微量法100管/96樣550
QS1008單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)測試盒紫外分光光度法50管/48樣800
MS1008單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)測試盒微量法100管/96樣1550
QS1009乙醛脫氫酶(ALDH)測試盒紫外分光光度法50管/48樣420
MS1009乙醛脫氫酶(ALDH)測試盒微量法100管/96樣800
QS1010NAD激酶(NADK)測試盒可見分光光度法50管/48樣600
MS1010NAD激酶(NADK)測試盒微量法100管/48樣1100
QS1011線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-輔酶Q還原酶測試盒   紫外分光光度法25管/24樣1280
MS1011線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-輔酶Q還原酶測試盒   微量法100管/96樣2500

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